Čūsku inde satur fermentus, kas hidrolizē karboksilestera saites.Hidrolīzes substrāti ir fosfolipīdi, acetilholīns un aromātiskais acetāts.Šie fermenti ietver trīs veidu enzīmus: fosfolipāzi, acetilholīnesterāzi un aromātisko esterāzi.Čūsku indē esošā arginīna esterāze var hidrolizēt arī sintētisko arginīnu vai lizīnu, taču dabā tā galvenokārt hidrolizē proteīnu peptīdu saites, tāpēc pieder pie proteāzes.Šeit aplūkotie fermenti iedarbojas tikai uz esteru substrātiem un nevar iedarboties uz nevienu peptīdu saiti.Starp šiem fermentiem acetilholīnesterāzes un fosfolipāzes bioloģiskās funkcijas ir svarīgākas un ir pilnībā izpētītas.Dažām čūsku indēm ir spēcīga aromātiskās esterāzes aktivitāte, kas var hidrolizēt p-nitrofeniletilesteri, a- vai P-naftalīna acetātu un indola etilesteri.Joprojām nav zināms, vai šo aktivitāti rada neatkarīgs enzīms vai zināma karboksilesterāzes blakusparādība, nemaz nerunājot par tās bioloģisko nozīmi.Kad Agkistrodon halys Japonicus inde tika reaģēta ar p-nitrofeniletilesteri un indola etilesteri, p-nitrofenola un indola fenola hidrolizāti netika atrasti;Gluži pretēji, ja šie esteri reaģēs ar kobra Zhoushan pasugas čūsku indi un Bungarus multicinctus čūsku indi, tie ātri tiks hidrolizēti.Ir zināms, ka šīm kobras indēm ir spēcīga holīnesterāzes aktivitāte, kas var būt atbildīga par iepriekš minēto substrātu hidrolīzi.Faktiski Mclean et al.(1971) ziņoja, ka daudzas čūsku indes, kas pieder pie Cobra ģimenes, var hidrolizēt indola etilesteri, naftalīna etilesteri un butilnaftalīna esteri.Šīs čūsku indes nāk no: kobras, melnās kakla kobras, melnās lūpu kobras, zelta kobras, ēģiptiešu kobras, karaliskās kobras, zelta kobras mambas, melnās mambas un baltās lūpas mambas (D. aw joprojām pazīst austrumu rombolas klaburčūsku
Čūskas inde var hidrolizēt metilindola etilesteri, kas ir substrāts holīnesterāzes aktivitātes noteikšanai serumā, taču šī čūskas inde neuzrāda holīnesterāzes aktivitāti.Tas liecina, ka kobras indē ir nezināma esterāze, kas atšķiras no holīnesterāzes.Lai izprastu šī fermenta būtību, ir nepieciešams turpmāks atdalīšanas darbs.
1, fosfolipāze A2
(I) Pārskats
Fosfolipāze ir enzīms, kas var hidrolizēt glicerilfosfātu.Dabā ir 5 fosfolipāžu veidi, proti, fosfolipāze A2 un fosfolipāze
A. , fosfolipāze B, fosfolipāze C un fosfolipāze D. Čūsku inde galvenokārt satur fosfolipāzi A2 (PLA2), dažas čūsku indes satur fosfolipāzi B, un citas fosfolipāzes galvenokārt atrodamas dzīvnieku audos un baktērijās.Attēlā 3-11-4 parādīta šo fosfolipāžu darbības vieta substrāta hidrolīzē.
Starp fosfolipāzēm PLA2 ir pētīts vairāk.Tas var būt visvairāk pētītais enzīms čūsku indē.Tās substrāts ir estera saite Sn-3-glicerofosfāta otrajā pozīcijā.Šis enzīms ir plaši atrodams čūsku indē, bišu indē, skorpiona indē un dzīvnieku audos, un PLA2 ir daudz četrās ģimenes čūsku indēs.Tā kā šis enzīms iznīcina sarkanās asins šūnas un izraisa hemolīzi, to sauc arī par "hemolizīnu".Daži cilvēki sauc arī par PLA2 hemolītisko lecitināzi.
Ludeeke vispirms atklāja, ka čūsku inde var radīt hemolītisku savienojumu, iedarbojoties uz lecitīnu caur fermentiem.Vēlāk Delezenne et al.pierādīts, ka, kad kobras inde iedarbojas uz zirga serumu vai dzeltenumu, tā veido hemolītisku vielu.Tagad ir zināms, ka PLA2 var tieši iedarboties uz eritrocītu membrānas fosfolipīdiem, iznīcinot eritrocītu membrānas struktūru un izraisot tiešu hemolīzi;Tas var iedarboties arī uz serumu vai pievienoto lecitīnu, veidojot hemolītisko lecitīnu, kas iedarbojas uz sarkanajām asins šūnām, izraisot netiešu hemolīzi.Lai gan PLA2 ir daudz četrās čūsku indu ģimenēs, fermentu saturs dažādās čūsku indēs ir nedaudz atšķirīgs.Klaburčūska (C
Čūsku inde uzrādīja tikai vāju PLA2 aktivitāti.Tabula 3-11-11 ilustrē PLA2 aktivitātes salīdzinājumu 10 galvenajām indīgo čūsku indēm Ķīnā.
3-11-11 tabula 10 čūsku indu fosfolipāzes VIII aktivitāšu salīdzinājums Ķīnā
Čūsku inde
Tauku atbrīvošana
Alifātiskā skābe,
Cjumol/mg)
Hemolītiskā aktivitāte CHU50/^ g * ml)
Čūsku inde
Atbrīvojiet taukskābes
(^raols/mg)
Hemolītiskā aktivitāte “(HU50/ftg * 1111)
Najanaja atra
9. 62
vienpadsmit
Micracephal ophis
pieci komats viens nulle
kalyspallas
8. 68
divi tūkstoši astoņi simti
gracilis
V, acutus
7. 56
* * #
Ophiophagus hannah
trīs punkti astoņi divi
simts četrdesmit
Bnugarus fasctatus
7,56
divi simti astoņdesmit
B. multicinctus
viens punkts deviņi seši
divi simti astoņdesmit
Odze un russelli
septiņi punkti nulle trīs
T, mucrosquamatus
viens punkts astoņi pieci
Siamensis
T. stejnegeri
0. 97
(2) Atdalīšana un attīrīšana
PLA2 saturs čūsku indē ir liels, un tas ir stabils pret karstumu, skābēm, sārmiem un denaturantu, tāpēc to ir viegli attīrīt un atdalīt PLA2.Parastā metode ir vispirms veikt neapstrādātas indes gēla filtrēšanu, pēc tam veikt jonu apmaiņas hromatogrāfiju, un nākamo darbību var atkārtot.Jāatzīmē, ka PLA2 liofilizēšana pēc jonu apmaiņas hromatogrāfijas nedrīkst izraisīt agregāciju, jo liofilizēšanas process bieži palielina jonu stiprumu sistēmā, kas ir svarīgs faktors, kas izraisa PLA2 agregāciju.Papildus iepriekš minētajām vispārīgajām metodēm ir izmantotas arī šādas metodes: ① Wells et al.② PLA2 substrāta analogs tika izmantots kā ligands afinitātes hromatogrāfijai.Šis ligands var saistīties ar PLA2 čūsku indē ar Ca2+.EDTA galvenokārt izmanto kā eluentu.Pēc Ca2+ atdalīšanas afinitāte starp PLA2 un ligandu samazinās, un to var atdalīt no liganda.Citi izmanto 30% organisko šķīdumu vai 6 mol/l urīnvielu kā eluentu.③ Hidrofobā hromatogrāfija tika veikta ar PheiiylSephar0SeCL-4B, lai noņemtu PLA2 pēdas kardiotoksīnā.④ Anti PLA2 antiviela tika izmantota kā ligands, lai veiktu PLA2 afinitātes hromatogrāfiju.
Līdz šim ir attīrīts liels skaits čūsku indes PLAZ.Tu et al.(1977) uzskaitīja PLA2, kas attīrīts no čūsku indes pirms 1975. gada. Pēdējos gados katru gadu tiek ziņots par lielu skaitu rakstu par PLA2 atdalīšanu un attīrīšanu.Šeit mēs koncentrējamies uz ķīniešu zinātnieku veikto PLA atdalīšanu un attīrīšanu.
Chen Yuancong et al.(1981) atdalīja trīs PLA2 sugas no Agkistrodon halys Pallas indes Džedzjanā, kuras pēc to izoelektriskajiem punktiem var iedalīt skābā, neitrālā un sārmainā PLA2.Saskaņā ar tā toksicitāti neitrālais PLA2 ir toksiskāks, kas ir identificēts kā presinaptiskais neirotoksīns Agkistrodotoksīns.Sārmains PLA2 ir mazāk toksisks, un skābajam PLA2 gandrīz nav toksicitātes.Wu Xiangfu et al.(1984) salīdzināja trīs PLA2 īpašības, tostarp molekulmasu, aminoskābju sastāvu, N-galu, izoelektrisko punktu, termisko stabilitāti, enzīmu aktivitāti, toksicitāti un hemolītisko aktivitāti.Rezultāti parādīja, ka tiem bija līdzīga molekulmasa un termiskā stabilitāte, taču tiem bija būtiskas atšķirības citos aspektos.Enzīmu aktivitātes aspektā skābo enzīmu aktivitāte bija augstāka nekā sārmainā enzīmu aktivitāte;Sārmainā enzīma hemolītiskā iedarbība uz žurku sarkanajām asins šūnām bija visspēcīgākā, kam sekoja neitrāls enzīms, un skābais enzīms gandrīz nebija hemolizēts.Tāpēc tiek spekulēts, ka PLAZ hemolītiskā iedarbība ir saistīta ar PLA2 molekulas lādiņu.Zhang Jingkang et al.(1981) ir izgatavojuši Agkistrodotoksīna kristālus.Tu Guangliang et al.(1983) ziņoja, ka toksisks PLA ar izoelektrisko punktu 7,6 tika izolēts un attīrīts no Vipera rotundus indes no Fujian, un tās fizikālajām un ķīmiskajām īpašībām, aminoskābju sastāvu un 22 aminoskābju atlikumu secību N. -termināls tika noteikts.Li Yuesheng et al.(1985) izolēja un attīrīja citu PLA2 no Viper rotundus indes Fujianā.PLA2* apakšvienība ir 13 800, izoelektriskais punkts ir 10,4, un īpatnējā aktivitāte ir 35/xnioI/miri mg. Izmantojot lecitīnu kā substrātu, fermenta optimālais pH ir 8,0 un optimālā temperatūra ir 65 °C. LD5 injicēts intravenozi pelēm.Tas ir 0,5 ± 0,12 mg/kg.Šim fermentam ir acīmredzama antikoagulanta un hemolītiska iedarbība.Toksiskā PLA2 molekula sastāv no 123 atlikumiem no 18 veidu aminoskābēm.Molekula ir bagāta ar cisteīnu (14), asparagīnskābi (14) un glicīnu (12), bet satur tikai vienu metionīnu, un tās N-galā ir serīna atlikums.Salīdzinot ar Tuguang izolēto PLA2, abu izoenzīmu molekulmasa un aminoskābju atlikumu skaits ir ļoti līdzīgs, un arī aminoskābju sastāvs ir ļoti līdzīgs, bet asparagīnskābes un prolīna atlikumu skaits ir nedaudz atšķirīgs.Guangxi karaliskās kobras čūskas inde satur bagātīgu PLA2.Shu Yuyan et al.(1989) no indes izolēja PLA2, kura īpatnējā aktivitāte ir 3,6 reizes lielāka nekā oriģinālajai indei, molekulmasa 13000, sastāvs no 122 aminoskābju atlikumiem, izoelektriskais punkts 8,9 un laba termiskā stabilitāte.No elektronu mikroskopa novērojumiem par pamata PLA2 ietekmi uz sarkanajām asins šūnām var redzēt, ka tam ir acīmredzama ietekme uz cilvēka sarkano asins šūnu membrānu, bet tai nav acīmredzamas ietekmes uz kazas sarkanajām asins šūnām.Šim PLA2 ir acīmredzama aizkavējoša iedarbība uz sarkano asins šūnu elektroforēzes ātrumu cilvēkiem, kazām, trušiem un jūrascūciņām.Chen et al.Šis enzīms var kavēt trombocītu agregāciju, ko izraisa ADP, kolagēns un nātrija arahidonskābe.Ja PLA2 koncentrācija ir 10/xg/ml~lOOjug/ml, trombocītu agregācija tiek pilnībā inhibēta.Ja kā materiāli tika izmantoti mazgāti trombocīti, PLA2 nevarēja kavēt agregāciju koncentrācijā 20Mg/ml.Aspirīns ir ciklooksigenāzes inhibitors, kas var kavēt PLA2 ietekmi uz trombocītiem.PLA2 var kavēt trombocītu agregāciju, hidrolizējot arahidonskābi, lai sintezētu tromboksānu A2.PLA2 šķīduma konformācija, ko ražo Agkistrodon halys Pallas inde Džedzjanas provincē, tika pētīta, izmantojot cirkulāro dikroismu, fluorescenci un UV absorbciju.Eksperimentālie rezultāti parādīja, ka šī enzīma galvenā ķēdes konformācija bija līdzīga tāda paša veida enzīmam no citām sugām un ģintīm, skeleta konformācijai bija laba karstumizturība, un strukturālās izmaiņas skābajā vidē bija atgriezeniskas.Aktivatora Ca2+ un enzīma kombinācija neietekmē triptofāna atlieku vidi, savukārt inhibitors Zn2+ dara pretējo.Veids, kādā šķīduma pH vērtība ietekmē fermentu aktivitāti, atšķiras no iepriekšminētajiem reaģentiem.
Čūsku indes PLA2 attīrīšanas procesā acīmredzama parādība ir tāda, ka čūskas inde satur divus vai vairākus PLA2 eluēšanas maksimumus.Šo parādību var izskaidrot šādi: ① izoenzīmu esamības dēļ;② Viena veida PLA2 tiek polimerizēts dažādos PLA2 maisījumos ar dažādu molekulmasu, no kuriem lielākā daļa ir diapazonā no 9 000 līdz 40 000;③ PLA2 un citu čūsku indes komponentu kombinācija sarežģī PLA2;④ Tā kā amīda saite PLA2 tiek hidrolizēta, lādiņš mainās.① un ② ir izplatīti, tikai ar dažiem izņēmumiem, piemēram, PLA2 CrWa/w čūsku indē
Ir divas situācijas: ① un ②.Trešais stāvoklis PLA2 ir konstatēts šādu čūsku indē: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, palestīniešu odze, smilšu odze un briesmīgā klaburčūska km.
Gadījuma ④ rezultāts liek PLA2 migrācijas ātrumam mainīties elektroforēzes laikā, bet aminoskābju sastāvs nemainās.Peptīdus var sadalīt hidrolīzes ceļā, bet parasti tie joprojām ir saistīti ar disulfīda saitēm.Austrumu bedres klaburčūskas inde satur divas PLA2 formas, ko attiecīgi sauc par a un tipa p PLA2.Atšķirība starp šiem diviem PLA2 veidiem ir tikai viena aminoskābe, tas ir, glutamīns vienā PLA2 molekulā tiek aizstāts ar glutamīnskābi otrā PLA2 molekulā.Lai gan precīzs šīs atšķirības iemesls nav skaidrs, parasti tiek uzskatīts, ka tas ir saistīts ar PLA2 deamināciju.Ja PLA2 palestīniešu odzes indē tiek uzturēts silts ar neapstrādāto indi, gala grupu tā enzīmu molekulās kļūs vairāk nekā iepriekš.No C PLA2, kas izolēts no čūskas indes, ir divi dažādi N-termināli, un tā molekulmasa ir 30 000. Šo parādību var izraisīt PLA2 asimetriskais dimērs, kas ir līdzīgs simetriskajam dimēram, ko PLA2 veido austrumu dimanta klaburčūskas indē. un rietumu diamondback klaburčūska.Āzijas kobra sastāv no daudzām pasugām, no kurām dažas nav īpaši klasificētas.Piemēram, tagad tiek atpazīta tā, ko agrāk sauca par Kobra ārējās Kaspijas apakšsugu
To vajadzētu attiecināt uz Kaspijas ārējās jūras kobru.Tā kā pasugas ir daudz un tās ir sajauktas kopā, čūsku indes sastāvs ir ļoti atšķirīgs dažādu avotu dēļ, un arī PLA2 izoenzīmu saturs ir augsts.Piemēram, kobras inde
Vismaz 9 veidu R ^ ll sugu PLA2 izoenzīmi tika atrasti, bet kobras pasugas Kaspijas indē tika atrasti 7 veidu PLA2 izoenzīmi.Durkins et al.(1981) pētīja PLA2 saturu un izoenzīmu skaitu dažādās čūsku indēs, tostarp 18 kobras indēs, 3 mambas indēs, 5 odžu indēs, 16 klaburčūsku indes un 3 jūras čūsku indes.Kopumā kobras indes PLA2 aktivitāte ir augsta, ar daudziem izoenzīmiem.Odzes indes PLA2 aktivitāte un izoenzīmi ir vidēji.Mamba indes un klaburčūskas indes PLA2 aktivitāte ir ļoti zema vai vispār nav PLA2 aktivitātes.Arī jūras čūsku indes PLA2 aktivitāte ir zema.
Pēdējos gados nav ziņots, ka PLA2 čūsku indē pastāvētu aktīva dimēra veidā, piemēram, austrumu rombofora klaburčūska (C. čūskas inde satur a un P tipa PLA2, kuras abas sastāv no divām identiskām apakšvienībām , un ir tikai dimerāze
Aktivitāte.Shen et al.arī ierosināja, ka enzīma aktīvā forma ir tikai čūskas indes PLA2 dimērs.Telpiskās struktūras izpēte arī pierāda, ka rietumu dimanta klaburčūskas PLA2 eksistē dimēra formā.Zivēdāju savienojums
Ir divas dažādas čūsku indes PLA ^ Ei un E2, kurās 仏 eksistē dimēra formā, dimērs ir aktīvs un tā disociētais monomērs ir neaktīvs.Lu Yinghua et al.(1980) tālāk pētīja E. Jayanthi et al. fizikālās un ķīmiskās īpašības un reakcijas kinētiku.(1989) no odzes indes izolēja pamata PLA2 (VRVPL-V).Monomēra PLA2 molekulmasa ir 10000, kam ir letāla, antikoagulējoša un tūskas iedarbība.Ferments var polimerizēt polimērus ar dažādu molekulmasu pie PH 4,8, un, palielinoties temperatūrai, palielinās polimēru polimerizācijas pakāpe un molekulmasa.96 ° C temperatūrā radītā polimēra molekulmasa ir 53 100, un šī polimēra PLA2 aktivitāte palielinās par diviem
Izlikšanas laiks: 18. nov. 2022